Генетический анализ
Современные молекулярно-генетические методики весьма изощрены, совершенствуются каждый год. Подобные исследования проводят с использованием современного, весьма дорогого оборудования. Ниже мы приводим алгоритм простейшего генетического исследования (например, в рамках генетического баркодинга):
Выделение ДНК проводится разнообразными методами (солевым, фенол-хлороформым, на ионообменных смолах). В настоящее время наибольшее распространение получили готовые наборы для выделения ДНК, предлагаемые различными фирмами.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) применяется для размножении определенного фрагмента ДНК in vitro. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. Для проведения ПЦР составляется смесь из двух праймеров (коротких фрагментов ДНК, комплиментарных противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК), смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), и фермента термостабильной ДНК-полимеразы в специальном буферном растворе с добавление ионов магния. ПЦР-реакция проводится в специальном приборе - амплификаторе. Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-40 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий: денатурации ДНК (расхождение двух цепей при температуре 96ºС), отжига (связывание праймеров с исходной ДНК при температуре, которая различна у разных праймеров) и элонгации (реплицирование ДНК с использованием праймеров в качестве затравок при 72-75ºС).Успешность ПЦР реакции обычно проверяют путем электрофореза полученных продуктов, с добавлением специальных красителей ДНК (в случае неудачной реакции полоска от ПЦР-продукта на геле отсутствует).
Сиквенс ПЦР фрагмента. Определение нуклеотидной последовательности ПЦР-продукта проводится в специальном приборе, называемом секвенатором. В результате получается описание первичной структуры ДНК в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Современные секвенаторы выдают эту информацию в виде компьютерных файлов.
Полученные последовательности обрабатываются в специальных компьютерных программах (BioEdit, Mega, Geneious и др.). Для последующего анализа последовательности ДНК всех особей, которые будут включены в анализ, должны быть выровнены, то есть размещены друг под другом таким образом, гомологичные участки и нуклеотидные пары помещались один под другим. Подобная процедура также выполняется при помощи специальных компьютерных программ или на специальных серверах on-line (Mafft, Muscle и др.)
При помощи специальных компьютерных программ производится построение филогенетических деревьев (или сетей гаплотипов в случае филогеографической работы) для исследуемой совокупности особей по различным алгоритмам.